一种可通过皮下注射的新型直接凝血酶抑制剂.pdf
目的:重组双功能水蛭素(RGD-hirudin)是在野生型水蛭素分子的合理部位融入了Arg-Gly-Asp(RGD)序列融合在野生型水蛭素的合理部位,具有抗凝血酶、抗血小板聚集的双重功能.但是RGD-Hirudin是一种蛋白质,只能通过静脉注射给药,临床应用范围有限.以RGD-hirudin序列为基础,保留其C末端和N末端的功能氨基酸残基,利用分子模拟和同源建模技术设计具有抗凝活性的短肽(DirectThrombinInhibitorPeptide,DTIP),以利于皮下用药.方法:利用同源建模和分子模拟,以RGD-hirudin的序列为基础,保留其功能氨基酸残基,借助分子模拟软件设计多肽类似物；利用毕赤酵母表达DTIP；经纯化后获得目的蛋白；利用毕赤酵母表达DTIP；经纯化后获得目的蛋白；凝血酶滴定法测定DTIP的抗凝活性；HPLC-MS测定DTIP的纯度、分子量,利用生物膜干涉技术测定凝血酶与DTIP的亲和力.在体外实验中,通过血栓弹力试验测定DTIP对血栓形成的抑制作用.大鼠皮下注射DTIP,比较给药前后部分凝血活酶时间(ActivatedPartialThromboplastinTime,aPTT),凝血酶原时间(ProthrombinTime,PT),凝血酶时间(ThrombinTime,TT)和凝血时间(ClottingTime)的变化.分别构建尾静脉注射肾上腺素和胶原诱导的急性肺栓塞模型和FeCl3损伤诱导的肠系膜微动脉血栓模型,研究DTIP预防血栓形成的药效学作用.结果:利用同源建模设计出一条具有抗凝活性的短肽DTIP；DTIP抗凝比活性为7000ATU/mg,与凝血酶的亲和力为0.9μMol/L.体内和体外试验结果均显示DTIP显著延长aPTT、PT和TT,体内试验中,用药后,CT也显著延长,但不会引起出血.在急性肺栓塞模型中,DTIP显著提高小鼠存活率；在肠系膜微动脉血栓模型中,DTIP抑制血栓的形成.结论:DTIP具有抗凝活性,且可以通过皮下注射的方式预防血栓的形成,可作为一种潜在的皮下注射直接凝血酶抑制剂进行更加深入的研究.
作者：赵冰 张艳玲 黄一农 于锦超 李亚然 王琪 马亦信 宋后燕 于敏 莫炜
作者单位：复旦大学基础医学院生物化学与分子生物学系;代谢与分子医学教育部重点实验室代谢与分子医学教育部重点实验室
母体文献：第九届国际分子模拟与信息技术应用学术会议(ICMS&I2018)论文集
会议名称：第九届国际分子模拟与信息技术应用学术会议(ICMS&I2018)
会议时间：2018年5月1日
会议地点：太原
主办单位：中国化学会,中科院,北京创腾科技有限公司
语种：chi
分类号：R96R97
关键词：直接凝血酶抑制剂 药物设计 分子模拟 同源建模 抗凝活性
在线出版日期：2019年6月27日
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