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T_CI 160-2022 极端环境真菌的分离、培养、保藏和应用技 ...
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T_CI 160-2022 极端环境真菌的分离、培养、保藏和应用技术指南
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黄金阳光
发表于 2024-9-29 15:09
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标准编号:T/CI160—2022
中文标题:极端环境真菌的分离、培养、保藏和应用技术指南
英文标题:Technicalguidelinesforisolation,culture,preservationandapplicationofextremeenvironmentalfungi
国际标准分类号:07.100.01微生物学综合
中国标准分类号:B04
国民经济分类:C276生物药品制品制造
发布日期:2022年12月15日
实施日期:2022年12月15日
起草人:张世宏、魏毅、于术军、刘庆玉、李凤兰、李桂华、耿丽娟、李柱刚、林汉明。
起草单位:沈阳农业大学、辽宁伊品九利农业科技发展有限公司、沈阳汉明种业有限公司、东北农业大学、吉林大学、沈阳市食品药品检验所、沈阳九利肥业股份有限公司、黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所、香港中文大学。
范围:本文件提供了极端环境真菌(以下简称“极端真菌”)的来源,分离、培养、鉴定、保藏方法和生物技术应用指南。本文件适用于极端真菌的分离、培养、鉴定、保藏与应用。
主要技术内容:极端环境真菌extremeenvironmentalfungi在常见普通真菌无法生存的极端环境条件下(如高温低温、高盐、高毒素、缺水、脱水、低氧厌氧、高低压强等)能够正常生长、发育、繁殖的真菌。注: 常见的普通真菌一般生长在温度22℃~36℃,湿度95%~100%,pH5~6.5的有氧环境。普通真菌对高/低温度、高渗透(高盐与脱水)、高毒素、低氧或厌氧、高低压强等敏感、适应性差。3.2 嗜冷真菌psychrophilicfungi最适生长温度小于等于15℃、最高生长温度小于等于25℃的真菌。3.3 嗜热真菌thermophilicfungi最适生长温度大于等于40℃、最低生长温度大于等于20℃的真菌。3.4 嗜盐真菌halophilicfungi在大于等于5%钠、钾等常规盐离子浓度环境生长最快的真菌。3.5 毒素降解真菌toxin-degradingfungi适宜于在毒素环境生存,具有将呕吐毒素(DON)、黄曲霉毒素(AFT)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等毒素降解为低毒或者无毒物质的真菌。3.6 钝化重金属真菌passivateheavymetalfungi适宜于在重金属污染环境生存,具有钝化重金属,使其缓慢氧化或化合,减少离子状态,从而缓解作物吸收的真菌。3.7 重金属heavemetal密度大于4.5g/cm3的金属。注: 在环境污染方面,重金属主要是指汞(水银)、镉、铅、铬以及类金属砷等生物毒性显著的重元素。重金属非常难以被生物降解,相反却能在食物链的生物放大作用下,成千百倍地富集,最后进入人体。重金属在人体内能和蛋白质及酶等发生强烈的相互作用,使它们失去活性,也可能在人体的某些器官中累积,造成慢性中毒。2018年我国颁布的《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)GB15618-2018》和《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准(试行)GB36600-2018》规定了土壤环境重金属污染上限指标,超过此指标即存在影响人类健康的危害,需要及时的修复和风控。砷在第一类土地中不能超过120mg/kg,第二类土地中不能超过140mg/kg。镉在第一类土地中不能超过47mg/kg,在第二类土地中不能超过172mg/kg。铬在第一类土地中不能超过30mg/kg,在第二类土地中不能超过78mg/kg。铅在第一类土地中不能超过800mg/kg,在第二类土地中不能超过2500mg/kg。汞在第一类土地中不能超过33mg/kg,在第二类土地中不能超过82mg/kg。5 试剂和材料5.1 除另有规定外,试剂为分析纯和蒸馏水。5.2 DNA胶回收试剂盒、各种毒素ELISA检测试剂盒、毒素荧光定量快速检测试纸条。5.3 2xTaqPCRStarMix:pcr预混液。5.4 极端真菌鉴定引物对ITS1和ITS4。5.5 50×TAE电泳缓冲液:称取242.0gTris-base、37.2gEDTA-Na2·2H2O、57.1mL冰醋酸,溶解于适量蒸馏水中,用10MNaOH溶液调节pH=8.3,补充水分定容至1000mL,室温保存。使用时需将50×TAE稀释为1×TAE。5.6 30%无菌甘油:水:甘油=7:3,121℃灭菌15min。5.7 CTAB溶液:称取20gCTAB、29.2gEDTA-Na2·2H2O、1MTris-HCl100mL(pH=8.0)、5MNaCl280mL,溶解于适量蒸馏水中,补充水分定容至1000mL,1%的β-巯基乙醇(现用现配),室温保存。5.8 氯仿异戊醇混合液:氯仿:异戊醇体积比为24:1,在通风橱中,将异戊醇加入到氯仿中混合均匀即可。5.9 10MNaOH溶液:称取400gNaOH,溶解于适量蒸馏水中,补充水分定容至1000mL,配制成10M的NaOH溶液。5.10 PBS磷酸盐缓冲液:称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶解于适量蒸馏水中。用盐酸调节pH=7.4,补充水分定容到1000mL,用0.22um的微孔滤膜抽滤灭菌。4℃保存。5.11 琼脂糖凝胶:称取10g琼脂糖,缓慢加入1×TAE缓冲液,加热使之充分溶解,配制成10g/L的琼脂糖凝胶。5.12 PDA培养基,按以下步骤制备:a) 称取200g去皮马铃薯,切成小块,加适量水煮沸20min~30min(能被玻璃棒戳破即可),用八层纱布过滤;b) 在过滤液加入18g琼脂粉,继续加热搅拌混匀,待琼脂粉溶解完后,加入20g葡萄糖,搅拌均匀,稍冷却后再补足水分至1000mL,分装玻璃试管或者锥形瓶,用封口膜封口,121℃灭菌15min。液体培养基PDB不加琼脂粉;c) PDA斜面培养基:分装量为玻璃试管高度的1/4(4mL~5mL),灭菌后趁热摆放斜面,制成斜面培养基,倾斜度为试管中的培养基约占试管长度的1/2。5.13 降解DON筛选培养基:称取1g(NH4)2SO4、3gKH2PO4、6gK2HPO4、0.5gNaCl、0.5gMgSO4·7H2O、0.05gCaCl2、0.001gFeSO4·7H2O、0.05g蛋白胨、20g琼脂粉,溶解于适量蒸馏水中,用盐酸调节pH=6.0~7.0,补充水分定容至1000mL,121℃灭菌15min。灭菌后,待冷却至50℃~60℃时,在无菌操作台里加入抽滤除菌的氧化苯乙烯,终浓度为15mmol/L,趁热倒入培养皿,待培养基凝固即制成脱氧雪腐镰刀菌烯醇筛选培养基平板,置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。注: 氧化苯乙烯是脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素)类似物,可替代DON进行初步筛选高效降解DON毒素真菌。5.14 降解AFT筛选培养基:称取5.0g(NH4)2SO4、2.5gKH2PO4、1.0gMgSO4、0.5gNa2HPO4·12H2O、0.1gCaCl2、20g琼脂粉,溶解于适量蒸馏水中,用盐酸调节pH=6.5,补充水分定容至1000mL,121℃灭菌15min。灭菌后,待冷却至50℃~60℃时,在无菌操作台里加入抽滤除菌的香豆素溶液,终浓度为1g/L,趁热倒入培养皿,待培养基凝固即制成黄曲霉毒素筛选培养基平板,置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。注: 香豆素是黄曲霉毒素(AFT)类似物,可替代AFT进行初步筛选高效降解AFT毒素真菌。5.15 降解ZEN筛选培养基:称取2.0g(NH4)2SO4、0.5gNaH2PO4、0.5gK2HPO4、0.2gMgSO4、0.1gCaCl2、20g琼脂粉,溶解于适量蒸馏水中,用盐酸调节pH=7.0,补充水分定容至1000mL,121℃灭菌15min。灭菌后,待冷却至50℃~60℃时,在无菌操作台里加入抽滤除菌的赤霉烯酮溶液,终浓度为1g/L,趁热倒入培养皿,待培养基凝固即制成玉米赤霉烯酮毒素筛选培养基平板,置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。5.16 含有重金属的PDA培养基制备:PDA培养基配方同5.12,调节pH=5.0(防止重金属沉淀),121℃灭菌15min。灭菌后,待冷却至50℃~60℃时,在无菌操作台里加入过滤除菌的重金属溶液,趁热倒入培养皿,待培养基凝固即制成重金属PDA培养基,置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。5.17 含有NaCl的PDA培养基:PDA培养基配方同5.12,pH值自然,加入NaCl制成不同质量分数(%)的NaClPDA培养基。液体培养基不加琼脂粉。5.18 琼脂粉培养基:称取琼脂粉18g,溶解于适量蒸馏水中,补充水分定容至1000mL,121℃灭菌15min。5.19 培养基的无菌检测:将灭菌后的培养基放在28℃~34℃培养箱中,培养1~3天,检查合格后将其保存于4℃或者室温。
关键词:中国国际科技促进会,T/CI,生物药品制品制造,真菌,应用技术,环境
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